現代生物技術，尤其是合成生物學的快速發展，使得我們能夠通過基因改造賦予植物新的性狀。植物基因組的精確修飾可以通過同源重組或基因編輯實現，而新基因也可以通過隨機整合的方式導入植物基因組。然而，在高等植物中，通過同源重組進行基因靶向（gene targeting）修飾的效率通常極低，這成為精確修飾植物基因組的主要障礙之一。農桿菌介導的T-DNA隨機整合到植物基因組是一種常用的基因導入工具，但篩選轉基因植物需要使用選擇標記（selection marker），而公眾對選擇標記可能對人類健康造成的潛在風險表示擔憂。目前，歐盟超過一半的國家已正式禁止轉基因（genetically modified）作物的種植。因此，開發無選擇標記的DNA導入技術對于安全轉基因應用具有重要意義，相關研究也備受關注。盡管已有多種策略被探索，如共轉化、轉座元件和位點特異性重組等，但這些方法通常操作繁瑣且效率不高。

2025年2月5日，Plant Direct在線發表上海師范大學王水團隊題為“Delivery of Marker-Free DNA to Plant Genome by the Transgenic Selection-Associated Fragment Elimination (T-SAFE) System”的研究論文。該研究成功建立了一種簡單、高效且安全的方法，能夠向植物基因組遞送大片段DNA（>10 kb），為植物基因改造提供了新的技術手段。

該研究開發了一種基于CRISPR/Cas9技術的簡化高效系統，稱為Transgenic Selection-Associated Fragment Elimination （T-SAFE）系統（圖1）。T-SAFE系統由四個模塊組成：選擇標記、CRISPR/Cas9、間隔序列加原間隔序列相鄰基序（SP）和遞送的DNA。其中，選擇標記和CRISPR/Cas9模塊合稱為SCC。SCC兩側是兩個源自果蠅Ebony基因的相同SP（SP-F和SP-R，序列方向相反），這些序列能夠在外源DNA整合到植物基因組時，有效引導Cas9切割包含選擇標記基因的SCC，從而實現選擇標記的自我消除。此外，為了抑制細菌中功能性Cas9蛋白的產生，研究團隊將馬鈴薯ST-LS1基因的IV2內含子整合到Cas9基因中；同時，為了避免在非生殖植物細胞中發生SCC切割，Cas9基因由生殖細胞特異性啟動子或誘導型啟動子驅動。這些創新設計使T-SAFE系統在擬南芥轉基因植物中選擇標記的消除效率達到10-30%，在水稻中達到5-8%，且DNA遞送能力超過10 kb。這一方法為植物基因改造提供了一種安全可靠的新途徑。

T-SAFE系統示意圖

（A）T-SAFE系統由四個模塊組成：選擇標記（selection marker）、CRISPR/Cas9、SP（SP-F和SP-R，序列方向相反）和遞送的DNA（Cargo）。（B）DNA整合到植物基因組后，sgRNA引導Cas9有效切割SCC兩端的SP。（C）自我消除SCC后，無選擇標記的目標DNA成功地送到植物基因組。引物對F1/C-R和F2/C-R分別用于檢測植物中整合片段是否含有SCC。采用TAIL-PCR擴增整合片段側翼的植物基因組序列。根據TAIL-PCR結果，設計了兩對引物PG-F/C-R和PG-F/PG-R，用于鑒定基因組DNA片段與SCC切割后的目標DNA片段的整合情況。

上海師范大學生命科學學院卓越創新班本科生楊奕為論文第一作者，王水研究員為通訊作者。實驗室研究生常歡、潘鐳文、郭東北、彭順、毛婷和張悅慧等同學參與了本項研究。相關工作得到了國家自然科學基金委和上海市植物種質資源開發協同創新中心等項目的資助。

（供稿、圖片：生命科學學院）