近日，Plant Biotechnology Journal雜志在線發表了我校生命科學學院張輝教授團隊的最新研究成果“Efficient creation of decorative double-flowered petunia through CRISPR/Cas9-mediated simultaneous editing of PMADS3 and FBP6 genes”。該研究針對傳統育種中重瓣花品種較難獲得的瓶頸問題，利用高效的多位點CRISPR/Cas9基因編輯技術，實現對矮牽牛中兩個調控雄蕊和心皮發育的C類基因PMADS3與FBP6的同時精準敲除，成功創制出層次豐富、性狀穩定的“花中花”型重瓣矮牽牛，具有極高的觀賞性和廣闊的應用潛力。本研究不僅為重瓣花卉的精準生物育種提供了可行方案，也為提升我國花卉種質創新能力提供了新思路。

重瓣花因其更強的觀賞性和稀缺性，在花卉植物中被視為最具吸引力的性狀之一。大多數重瓣花是由于雄蕊瓣化以及心皮轉化為額外花器官所形成的。根據經典的ABC花器官發育模型，C類AGAMOUS（AG）基因控制雄蕊與心皮的發育及花決定性（floral determinacy）（Bowman et al.,1989; Schwarz-Sommer et al., 1990）。當C類基因發生突變時，通常會導致同源異型轉化（即一個器官發育為另一個器官），如雄蕊轉化為花瓣，心皮轉化為類似花瓣的新器官，從而形成重瓣花。長期以來，研究者嘗試利用自然變異或誘變方式獲得AG類基因的功能缺失突變體，以創制重瓣花品種。然而，由于大多數植物通常攜帶兩個功能冗余的AG類同源基因，使得通過自然或誘變手段獲得完全敲除型突變體十分困難（Kramer et al., 2004）。此外，由于重瓣花中雄蕊和心皮發育異常，難以通過雜交手段將該性狀轉移到其他品種。

現代生物技術為利用AG類基因創制重瓣品種提供了新機遇（Zhang et al., 2020）。例如，研究人員通過嵌合抑制子基因沉默技術（Chimeric repressor gene-silencing technology, CRES-T），有效降低了仙客來（Cyclamen persicum）中AG類基因CpAG1和CpAG2的表達，成功獲得重瓣仙客來（Tanaka et al., 2013）。近年來，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，研究者在夏堇（Torenia fournieri）中敲除兩個AG類基因TfFAR和TfPLE，使得雄蕊轉變為花瓣，心皮轉變為花瓣狀器官；而在龍膽（G. scabra × G. triflora）中敲除AG1類基因，則僅使雄蕊轉變成花瓣，心皮發育未受顯著影響（Sasaki and Ohtsubo, 2020；Nishihara et al., 2023）。

矮牽牛作為園林應用廣泛的花壇植物，素有“草花皇后”之稱，但其重瓣品種極為稀少。該物種中含有兩個AG同源基因——PETUNIA MADS BOX GENE3（PMADS3）和FLORAL BINDING PROTEIN6（FBP6），二者在雄蕊、心皮發育及花決定性調控中具有功能冗余性（Angenent et al., 1993；Tsuchimoto et al., 1993）。已有研究嘗試通過RNA干擾（RNAi）技術同時下調這兩個基因的表達，誘導雄蕊瓣化和心皮重構為額外花器官，從而形成重瓣花表型（Heijmans et al., 2012；Noor et al., 2014）。然而，RNAi方法在植物中常面臨靶基因沉默效率低、性狀遺傳不穩定等問題，難以實現可用于育種的穩定材料創制（Chaudhary et al., 2024）。

針對上述問題，上海師范大學張輝教授團隊利用CRISPR/Cas9技術，在實驗室常用品種W115（Mitchell）與商業品種Mirage Rose中同時敲除了PMADS3和FBP6基因，成功獲得了一系列不同程度的重瓣矮牽牛，該研究為在不同花卉植物中創制重瓣品種提供了可行的技術策略。

全文主要研究結果如下：

構建eDGE1載體并實現對PMADS3與FBP6基因的靶向編輯

在常用的雙子葉基因編輯載體（由AtU6啟動子驅動sgRNA表達，35S啟動子驅動Cas9表達）的基礎上，研究者引入了已知可顯著提升遺傳轉化再生效率的葡萄來源的GRF4-GIF1嵌合元件（Debernardi et al., 2020）。此外，在GRF4的miR396結合序列引入6個同義突變用于進一步提高效率，從而構成出增強型雙子葉基因編輯載體eDGE1 (enhanced dicot genome editing 1)（圖1A）。為實現對PMADS3與FBP6基因的靶向編輯，研究者在這兩個基因的第一外顯子區域設計了特異性gRNA序列（圖1B），并利用已被證實在矮牽牛中表現良好的tRNA多靶點表達系統(Xie et al., 2015; Sun et al., 2018)，將兩個靶序列同時克隆至eDGE1載體中。

該編輯載體隨后用于轉化實驗室常用的矮牽牛二倍體品種W115（Mitchell）。在獲得的16棵轉化株系中，FBP6的編輯效率達100%，其中純合或雙等位突變率為43.75%，雜合/嵌合突變率為56.25%；PMADS3的編輯效率為37.50%（圖1C）。研究者選擇了#4與#12兩個代表性突變株系進行后續分析：其中，#4株系中PMADS3為WT/+1bp雜合突變，FBP6為-1bp/-4bp雙等位突變；#12株系中PMADS3為WT/+1bp雜合突變，FBP6為-1bp的純合突變（圖1D）。表型觀察顯示，這兩個株系的花藥均發生了明顯的瓣化轉化，并伴隨柱頭結構異常：#4株系的柱頭呈現線狀分裂形態，#12株系的柱頭則體積顯著增大，并發生明顯裂開（圖1E）。以上結果表明，盡管PMADS3仍處于雜合狀態，FBP6的單基因突變已可顯著誘導雄蕊瓣化并導致弱重瓣花表型的形成。

靶向編輯PMADS3與FBP6基因在矮牽牛W115中形成弱重瓣花表型

在商業化矮牽牛中同時靶向編輯PMADS3與FBP6創制豐富的重瓣花

為驗證該基因編輯策略在不同品種中的通用性，研究者進一步在商業矮牽牛品種 Mirage Rose 中同時敲除了 PMADS3 和 FBP6 兩個基因。經反轉錄測序分析發現，Mirage Rose 與W115品種在PMADS3和FBP6的編碼序列完全一致，因此可直接采用前述構建的編輯載體進行遺傳轉化（圖1A）。

共獲得 120 株 Mirage Rose 再生植株。基因型檢測顯示，PMADS3 的編輯效率為 55.83%，其中 10.00% 為純合或雙等位突變體；FBP6 的編輯效率為 85.00%，其中 74.17% 為純合或雙等位突變體。兩個基因同時發生純合/雙等位突變的效率為 3.33%（圖2A）。

研究者從中篩選出株系 #40、#46 和 #105 進行進一步分析。#40 中 PMADS3 基因為 WT/+1 bp 雜合突變，FBP6 為 ?2 bp 純合突變；#46 的 PMADS3 為 +1 bp 純合突變，FBP6 為 ?6 bp 純合突變，該突變導致 MADS box 保守結構域中缺失兩個氨基酸；#105 的兩個基因均為雙等位突變，PMADS3 為 +1 bp/?1 bp，FBP6 為 ?1 bp/?3 bp（圖2B）。表型觀察顯示，這三株材料在整體植株形態上與野生型無顯著差異，但均表現出穩定的重瓣花表型（圖2C）。三者均出現明顯的雄蕊瓣化現象，但瓣化雄蕊形成的花瓣大小存在顯著差異（圖2E）：其中 #105 的瓣化花瓣最大，#40 最小。三株系均表現出心皮轉化成新花器官，但轉化程度有所不同：#40 的心皮轉化為未充分發育的花器官，#46 和 #105 的心皮則轉化成明顯的新花器官（圖2E）。其中， #105花中央形成了一個大的新花器官，呈現出 “花中花”形態，該重瓣花層次豐富、結構精美，具有極強的觀賞性（圖2E）。

不同株系之間重瓣程度的差異，與各自中兩個基因的突變情況密切相關：#105 的 PMADS3 與 FBP6 均為雙等位突變，導致C類基因功能的完全喪失，產生最為顯著的“花中花”型重瓣表型；#40 中 PMADS3 為雜合突變，FBP6 為純合突變，因此重瓣程度較弱；#46 中雖然兩個基因均為純合突變，但 FBP6  的 ?6 bp 缺失僅導致兩個氨基酸缺失，可能保留部分殘余功能，重瓣性狀介于兩者之間。這些結果進一步支持 PMADS3 和 FBP6 在調控雄蕊和心皮發育及花決定性方面具有高度的功能冗余性。

為進一步驗證突變材料中靶基因的表達變化，研究者對株系 #40、#46 和 #105 進行了 qRT-PCR 分析（圖2D）。與野生型相比，PMADS3 的表達量在 #40、#46 和 #105 中分別下降了約 79.14%、97.66% 和 98.02%；FBP6 的表達量分別下降了 97.00%、96.55% 和 89.51%，進一步證實了編輯效率和功能缺失效果。

在Mirage Rose中同時靶向編輯PMADS3與FBP6創制豐富的重瓣花

重瓣性狀可通過扦插實現穩定遺傳

為驗證基因編輯所獲得的重瓣表型在無性繁殖過程中的遺傳穩定性，研究者對株系 #40、#46 和 #105 進行了扦插繁殖實驗。結果顯示，所有扦插后獲得的植株均完整保留了母體的重瓣花特征，未觀察到性狀分離或退化現象。

該結果表明，通過CRISPR/Cas9 編輯獲得的重瓣性狀可在矮牽牛中通過營養繁殖方式實現穩定傳遞，具備良好的應用推廣前景。

基因編輯重瓣矮牽牛通過扦插繁殖保持性狀穩定性

花器官決定基因調控矮牽牛重瓣性狀的分子機制解析

為解析花器官決定基因在矮牽牛重瓣性狀形成中的分子機制，研究者對典型重瓣材料 #105 株系及其野生型對照的花瓣、雄蕊/心皮（或瓣狀器官）進行了RNA測序（RNA-seq）分析。

結果顯示，在野生型植株中，FBP6 和 PMADS3 基因在雄蕊/心皮組織中高表達，而在花瓣中幾乎不表達；相比之下，在 #105 株系的瓣狀器官中，這兩基因的表達水平顯著下降，分別為野生型的 6.43%（FBP6） 和 3.83%（PMADS3），與前述 qRT-PCR 分析結果一致（圖2D，圖4）。A類基因（FBP29、AP2 和 FBP26）在野生型花瓣中表達活躍，其中AP2表達量最高，但在雄蕊和心皮中的表達極低或幾乎不可檢測。在#105中，A類基因在花瓣中的表達水平與野生型相近，而在瓣狀器官中均表現出顯著上調，提示其參與瓣化結構的形成（圖4）。對于B類基因（TM6、GLO1、GLO2 和 DEF），除 TM6 外，其余基因（DEF、GLO1 和 GLO2）在野生型中于花瓣及雄蕊/心皮中均有表達，花瓣中表達水平略高。而在#105中，它們在瓣狀器官中的表達顯著升高，接近或達到花瓣水平，支持其在雄蕊瓣化過程中的作用（圖4）。值得注意的是，TM6 在野生型中主要在雄蕊/心皮中表達，在花瓣中表達較弱，而在#105中其在瓣狀器官中的表達顯著下降，接近花瓣表達水平，進一步支持其表達變化與器官命運轉化相關。

野生型與基因編輯重瓣矮牽牛中 ABC 類花器官發育基因的轉錄表達分析

進一步通過加權基因共表達網絡分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA），研究者發現 FBP6 與 PMADS3 具有最高的共表達相關性，表明它們在花器官發育中的緊密協同作用。此外，WGCNA還鑒定出多個與PMADS3和FBP6高度共表達的 MADS-box 家族轉錄因子成員，包括B類基因 TM6，以及此前未在重瓣調控中報道的 AGL19 和 MADS9，提示它們可能參與調控花決定性及瓣化過程，為后續創制重瓣花品種提供了新的潛在分子靶點。本研究展示了利用基因編輯技術在花卉重要性狀改良中的巨大應用潛力，未來有望將該策略拓展至其他觀賞植物，實現更多高品質花卉的定向創制與個性化設計育種，助力我國花卉產業從“產量型”向“品質型”與“創意型”轉型升級。

上海師范大學碩士生薛迎雙、副教授汪沖和碩士生葛容為論文共同第一作者，張輝教授為通訊作者。本研究得到了上海市農業科技創新計劃及崇明區農業科技創新項目的資助。

論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70236

(供稿、圖片：生命科學學院）